直肠癌占结直肠癌的35%，90%的直肠癌为腺癌，鳞状细胞癌占0.3%。由于直肠鳞状细胞癌的罕见性，对其发病机制、分子特征和治疗管理了解较少。目前，直肠鳞状细胞癌的治疗往往与肛门鳞状细胞癌类似，采用根治性放化疗，局部复发的患者不用手术治疗。本研究对10例直肠鳞状细胞癌样本进行了全面的分子特征分析（突变、拷贝数变异和HPV），并将其与肛门鳞状细胞癌和直肠腺癌进行了比较。直肠鳞状细胞癌HPV阳性率100%，突变谱（PIK3CA、PTEN、TP53、ATM、BCL6、SOX2）和拷贝数变异谱（3p、10p、10q、16q缺失和1q、3q、5p、8q、20p扩增）与肛门鳞状细胞癌类似。PI3K/Akt/mTOR通路基因变异发生率最高，与肛门鳞状细胞癌类似。直肠腺癌中最常见的基因扩增或缺失（FLT3、CDX2、GNAS、BCL2、SMAD4、MALT1）未见于直肠鳞状细胞癌。本研究首次对直肠鳞状细胞癌进行了全面的分子特征分析，证实了该罕见肿瘤的存在，以及其与肛门鳞状细胞癌分子特征的相似性。这种分子特征的相似性证实了基于组织学而非部位的治疗是合理的，提示直肠鳞状细胞癌的治疗应类似于肛门鳞状细胞癌，而非直肠腺癌。
研究背景
直肠癌（RC）约占结直肠癌（CRC）的35%，在欧洲，每年有125000例新发病例。其治疗与显著的致病率和死亡率相关。超过90%的直肠肿瘤为腺癌（ADC），直肠鳞状细胞癌（rSCC）非常罕见，占所有RC的0.2%-0.4%。结肠SCC更罕见。尽管人乳头瘤病毒（HPV）在肛门SCC（aSCC）发生中的作用已得到较多描述，但HPV与结直肠SCC的相关性仍存在争议，尚未得到证实。另一方面，Coghill等人的大型回顾性研究显示，晚期免疫抑制患者罹患rSCC的风险较高。在预后方面，分期匹配时，rSCC的预后似乎比直肠腺癌（rADC）差。Dyson等人表明，rSCC的预后不如结肠SCC。与生存较优相关的预后因素包括：早期、年轻、女性、非裔/美国人种族和使用放疗（RT）。
鉴于rSCC的罕见性，一些作者质疑其存在。原发性rSCC的诊断需要满足4个（William）标准：（1）肿瘤与肛门鳞状上皮或生殖道之间没有连续性；（2）其他原发部位没有SCC；（3）炎症性肠病患者无鳞状内衬瘘；（4）组织学证实。
免疫组化显示，与aSCC不同，rSCC和rADC表达细胞角蛋白CAM5.2，提示这两种直肠癌亚型具有共同的起源细胞。rSCC和aSCC常表达P63，rADC常表达CK20。与ADC相比，rSCC和aSCC似乎更常表达34bE12。
关于rSCC分期应采用哪种TNM分期（AJCC-肛门或AJCC-直肠），尚无明确共识。一项纳入2881例rSCC患者的大型研究得出结论，与AJCC直肠相比，AJCC肛门分期系统具有更好的预后分层能力，因此应作为预测患者生存的首选。
rADC采用放疗（RT）联合5-氟尿嘧啶（5-FU）化疗后手术治疗，而aSCC则采用根治性放疗同步丝裂霉素C（MMC）和5-FU化疗，局部复发的患者不用手术治疗。对于rSCC，没有明确的推荐。过去，基于回顾性和观察性研究，手术是标准治疗。最近，一些小型病例系列研究提示，根治性同步放化疗（CRT）可导致较高的部分或完全病理缓解率以及器官保留率。本研究旨在阐明HPV在rSCC中的作用，并比较rSCC、aSCC和rADC分子谱。
研究结果
患者特征
本研究纳入了10例rSCC患者。患者信息见表1。
表1. 患者信息
分子检测
HPV检测
所有患者（10/10）高危HPV16阳性，其中1例同时高危HPV18阳性。
NGS检测
每个样本检出0到13个突变。PIK3CA和PTEN基因致病性变异发生率最高（图1）。肿瘤突变负荷（每兆碱基的非同义突变数量）通常较低且具有异质性（范围：0-9 mut/Mb）。
图1. 10例rSCC患者体细胞突变频率和致病性
Oncoscan检测
图2展示了10例患者体细胞拷贝数变异（CNV）检测结果。在rSCC中，染色体3p、10p、10q和16q最常发生缺失，10q23区域包含PTEN基因（已发现杂合和纯合缺失）。染色体1q、3q、5p、8q和20p 最常发生扩增，3q26和3q27区域包含PIK3CA、SOX2、BCL6基因。
图2. 10例rSCC患者体细胞CNV谱
图3展示了Oncoscan检测显示的扩增或缺失频率最高的基因。扩增频率最高的基因是PIK3CA（8/10）、SOX2（9/10）、BCL6（9/10）、TERT（6/10）和BCL2L1（7/10）。缺失频率最高的基因是ATM（7/10）、PTEN（3/10）、RSF1（6/10）和RAF1（5/10）。
图3. 10例rSCC患者变异频率前50高的基因
突变和CNV——通路分析
综合分析体细胞突变和CNV，发现rSCC中PI3K/AKT/mTOR通路基因（PIK3CA、PTEN）变异发生率最高。
比较rSCC与rADC
使用TCGA数据库，获取了rADC中拷贝数变异（CNV）发生率最高的基因。扩增最常见于FLT3、CDX2、GNAS和BCL2L1基因，而缺失最常见于BCL2、SMAD4和MALT1基因。
为了直观地比较rSCC与rADC（图4），我们绘制了这2种肿瘤中缺失或扩增发生率最高的基因。图5比较了rSCC与rADC数据集拷贝数变异。使用R包拷贝数函数图像差绘制rSCC和rADC每个基因组片段的CNV平均值。在两张图中，rSCC中常见的CNV很少见于rADC，而rADC中最常见的CNV在rSCC中不存在。
图4. 比较rADC与10例rSCC变异频率前100高的基因
图5. rSCC与rADC数据集拷贝数变异
由于没有aSCC数据库，我们从文献中获取了数据。几项研究对aSCC进行了全面的基因组分析，显示PIK3CA、FBXW7、TP53、PTEN和ATM基因突变频率较高，与本研究中10例rSCC患者的情况相似。为了比较rSCC与rADC高频突变基因，使用公共rADC突变数据库，发现KRAS、TP53、APC和FBXW7突变频率较高，SMAD4、BRAF、CTNNB1和ERBB2突变频率较低。
讨 论
本研究纳入了根据William标准诊断为rSCC的10例患者，首次全面分析了rSCC的分子特征，包括HPV、基因突变和CNV。本研究数据证明了rSCC的存在，显示其与aSCC具有高度相似性，支持目前rSCC与aSCC类似的治疗方案，采用根治性CRT，局部复发患不用手术治疗。
所有患者均HPV阳性，高危HPV16是最普遍的基因型（10/10），1例（1/10）患者同时高危HPV18阳性。文献显示，88%的aSCC呈HPV阳性，其中HPV16是最常见的HPV亚型（占所有aSCC的75-80%），其次是HPV18（3.5-7%）。此外，2/10例患者携带TP53突变。在不同的研究中（25），aSCC中TP53突变的存在可能与HPV阴性肿瘤有关，提示预后不良以及肿瘤复发。与在aSCC中一样，将HPV视为rSCC风险因素是合理的，而在rADC不是如此。这一结果为rSCC治疗参照aSCC提供了额外的依据。
NGS分析显示，在rSCC中，PIK3CA和PTEN突变发生率最高（30%），其次是ERBB4、KDM6A和NFKBIA（20%）。最近的aSCC靶向测序研究显示，PIK3CA突变频率最高（30%），与本研究结果一致。有趣的是，在其他HPV相关癌症，如头颈癌或宫颈癌中，PIK3CA突变发生率也较高。PTEN突变发生率也为30%，突出了PI3K/Akt/mTOR通路在rSCC发生中的重要作用，与aSCC相似。在其他鳞状细胞癌或HPV相关癌中，PIK3CA和PTEN与靶向该通路的治疗疗效有关。Cacheux等人认为，PIK3CA突变可能在HPV相关SCC（包括肛门癌）中起重要作用，特别是在对CRT的耐药机制中。
在高频突变基因中，PIK3CA、PTEN和ATM突变潜在可靶向治疗。可以使用特异性酪氨酸激酶抑制剂靶向治疗，如阿培利司用于PIK3CA，AKT抑制剂如capivasertib用于PTEN，ATR抑制剂如elimusertib用于ATM。本研究发现rSCC突变谱与rADC突变谱几乎没有重叠。因此，rSCC常规检测KRAS，NRAS和BRAF突变可能没有太大意义。虽然不排除在少数情况下检出这些基因突变，但这些突变不太可能影响转移性rSCC的临床治疗决策。
rSCC中最常见的拷贝数变异包括染色体3p、10p和16q缺失，以及1q、3q、5p、8q和20p扩增。3p缺失和3q扩增是鳞状细胞癌的主要特征，可见于宫颈和肛门鳞状细胞癌、HPV阳性头颈部鳞状细胞癌以及食管鳞状细胞癌。宫颈癌最常见5p扩增，与HPV密切相关。8q扩增，特别8q24区域CSMD3、MYC和ASAP1基因扩增，已在不同类型癌症中被报道。染色体20p11扩增（C20orf3基因）与CRC患者肝脏特异性转移有关。
本研究可能存在几个局限。首先，由于所研究的肿瘤类型的罕见性，纳入的患者数量有限（10例患者），不确定这些患者的分子特征是否代表rSCCs的真实分子特征，特别是对于频率低于10%的变异，不过，相信本研究发现了一些高频变异。此外，与aSCC（已得到较多研究）分子特征的相似性，使我们确信本研究结果是最相关的变异。
另一个重要问题是，本研究中3例患者使用的是CRT后样本进行分子检测，因为这些样本肿瘤细胞比例较高。我们不能排除CRT引起一些基因变异的可能性（RT诱导的DNA双链断裂）。如果是这样，我们无法识别那些分子特征差异，因为没有与未经治疗的原发灶样本进行比较（肿瘤细胞含量低）。值得一提的是，一项研究中，比较aSCC原发灶和（CRT后）复发灶全外显子组测序结果，发现突变和突变负荷结果相同。
上述所有发现支持三个重要结论：首先，rSCC存在，并由特定临床标准定义。既往rSCC相关文献中数据的质量存在争议，因为不确定是否符合所有4个William标准（没有明确提及）。例如，其中一些研究没有说明是否满足了其中一项主要条件，肿瘤中心是否在齿状线上方（至少2 cm），肿瘤是否出现在肛门并延伸到直肠。本研究确保满足所有诊断标准。
此外，rSCC分子谱（基因突变，拷贝数变异）与aSCC相似，与rADC不同。最后，本研究证实rSCC的治疗应类似于aSCC，而不是rADC。针对rSCC患者的大型、多中心、正式、前瞻性临床试验将引起很大兴趣。需要对更大型队列进行全面分子检测，包括甲基化以及转录组学、表观遗传学和蛋白质组学分析，进一步明确rSCC的特征。这些研究还可以额外分析接受过或未接受过CRT治疗的患者突变特征的差异，看DNA损伤药物对分子特征的影响。此外，在rSCC等CRT用作根治性治疗的肿瘤中，识别CRT疗效预测性生物标志物具有意义，如果患者携带提示复发风险较高的预测因子（如PIK3CA突变），临床医生或许可以升级治疗，或加入新药，这可能是一项挑战。本研究强调了罕见癌症进行分子检测的重要性，可以指导临床管理。
参考文献：
Astaras C, De Vito C, Chaskar P, Bornand A, Khanfir K, Sciarra A, Letovanec I, Corro C, Dietrich PY, Tsantoulis P, Koessler T. The first comprehensive genomic characterization of rectal squamous cell carcinoma. J Gastroenterol. 2023 Feb;58(2):125-134. doi: 10.1007/s00535-022-01937-w. Epub 2022 Nov 11. PMID: 36357817; PMCID: PMC9876866.