自达芬奇的画作《蒙娜丽莎》声名远播后，有关它的研究就不曾断过，比如其时代意义，创作背景和过程，以及画中的神秘字符，还有它最显著的特点——微笑。
蒙娜丽莎的微笑相比这幅名画更为有名，不管是从哪个方向欣赏，蒙娜丽莎始终都在微笑，另外有研究人员利用微表情的理论得出结论：蒙娜丽莎的微笑中，含有83%的高兴、9%的厌恶、6%的恐惧和2%的愤怒。
一幅画作，之所以能够出名，最重要的也就是它的“灵魂”，微笑这一部分就是《蒙娜丽莎》的灵魂所在，并且达芬奇绝不可能是毫无预兆、毫无构思的创作出了这幅名画。
关于蒙娜丽莎的身份，在油画界和史学界一直是争论不休的话题，有人猜测蒙娜丽莎是某位贵族小姐，由于幼子夭折，整日郁郁寡欢，而达芬奇则想要通过绘画的方式让这位贵族小姐重获笑容。
不过意大利佛罗伦萨市教师吉乌塞普·帕兰蒂则提出了另一种说法，他认为蒙娜丽莎应该是达芬奇父亲的朋友吉奥康杜的妻子丽莎·格拉迪，丽莎·格拉迪生育有5个子女，夫妻俩的感情也一直不错，而达芬奇的父亲热心肠的花钱让儿子为朋友的妻子画下了这幅画。
但研究者发现，《蒙娜丽莎》的创作过程经过了四个阶段，首先是肖像草稿，其次，达芬奇曾用一幅《佩戴珍珠花饰的肖像画》覆盖了草稿；第三个阶段，则是达芬奇于1503年所创的《丽莎·格拉迪尼肖像》；最后才是现今我们所看到的《蒙娜丽莎》。
而当《蒙娜丽莎》镜像翻转后，暗藏的第二张脸就显露出来了，并且笑容消失了，再使用微表情理论也可得出另一种说法，第二张脸露出了不耐烦的神色，面带愠色，从而显得咄咄逼人。
另外将《蒙娜丽莎》倒立过来，微微侧立、左瞥的姿势，并使得“蒙娜丽莎”透露出了可怖感，再不是和蔼且优雅微笑的“蒙娜丽莎”。
事实上，达芬奇与父亲的关系并不是非常好，他的父亲瑟·皮耶罗·达·芬奇是个体面人，是佛罗伦萨的法律公证员，但母亲卡泰丽娜却是个农妇，而达芬奇其实是私生子，因此他并没有一个真正意义的姓。
达芬奇在5岁前是和母亲一同在芬奇的村镇生活，5岁后达芬奇并开始与父亲以及祖父母还有叔叔一块生活，另外达芬奇的父亲在此之后还结过几次婚，但与达芬奇的母亲再无交集。
达芬奇长大后，以一名音乐家的身份在米兰出名，值得一提的是，达芬奇多才多艺，不管是音乐、绘画，还是科学发明，所有事迹都表明，达芬奇的想象力丰富，而且有所根据。
达芬奇还曾担任过军事工程师，因此他的笔记中还包含了书中军事机械的设计。
1500年，达芬奇再次返回佛罗伦萨，并且开始创作《蒙娜丽莎》，这幅画名画中也运用到了透视法等多种绘画方法，也正是如此，“蒙娜丽莎”才留下了诸多谜底。